[2011.3.10] 向15分钟基因组测序的理想迈进

纳米孔测序

向15分钟基因组测序的理想迈进

遗传学：将DNA链通过一个叫纳米孔的小孔洞会极大的提高人类基因组的测序速度
Mar 10th 2011 | from the print edition

它（人类基因组计划）是国际科学合作所承担的最大型的项目之一，并最终取得了具有里程碑意义的成就。然而尽管有超过30亿美元的资金支持和成千上万的科学家参与，绘制人类基因组图谱的过程仍然耗费了十多年。测序技术从那时起已经有了巨大的改进：现在花费大约1万美元和八天时间给一个人的基因组测序已经成为可能。但是研究者梦想能够在数小时甚至是数分钟之内花费不到1千美元就完成整个测序。基因组测序到那时会变成家常便饭，检测疾病的遗传倾向或者分离的到个性化起作用的药物就变得更容易了。



让这种快速廉价的测序变为现实的最具前景的一个方法是一种叫做“纳米孔测序”的技术——让单条DNA链通过微小的纳米级的小洞或小孔，单独的碱基对（就是组成DNA的四个化学“字母”）就可以在它们通过纳米孔的时候一次一个的被识读出来。“我的理想是15分钟就可以把基因组测序，”牛津大学一位在纳米孔领域领跑的化学家Hagan Bayley说，“当你在医院诊疗的时候，大夫会把你的整个基因组测序。”

测序技术自人类基因组计划以来已经取得了重大的进步，但是仍需要将DNA复制数百万次——这一步叫做扩增，并将其挂上荧光标记。一个2005年成立致力于将Bayley博士对纳米孔的研究商业化的公司Oxford Nanopore的首席执行官Gordon Sanghera说，这是一个耗费时间的过程和一个严重的瓶颈问题。

“当下所有的系统都必须在化学上给DNA带上标识，并将其复制，这样就能够把它识读出来，”Sanghera博士说，“所以目前这种技术仅仅是准备ＤＮＡ就要花费5到10天。”然而如果是纳米孔技术，几乎不需要化学上的前处理，也不需要扩增。仅仅一条ＤＮＡ链就可以被识读出来，一次一个碱基对，不需要带上标识。而且现有的测序技术要把DNA破碎成少于100个碱基对的小片段。计算机巨擘IBM公司功能基因组和系统生物学研究组的负责人Gustavo Stolovitzky说，这些小片段得要被测序许多次，以便找到确定的交叉区段将它们拼接起来。纳米孔测序可以给更长的片段测序，这有助于提高测序速度。

纳米孔的来龙去脉

把比人类头发还细微大约5万倍的单条DNA链通过孔径仅有几个纳米（一纳米即十亿分之一米）的小孔听起来似乎是不可能的。但是这种现象在自然界中是家常便饭——有一种叫做离子通道的孔状蛋白，它可以在细胞膜上“打出”小孔并选择性的让某些离子通过。许多生物学过程依赖离子通道的这种能力来调节通过细胞膜的离子流。

上世纪90年代，受到这些蛋白的启发，Bayley博士开始寻求如何能够将离子通道作为一种生物分子感受器。他一开始用一种双层脂膜——一种具有高电阻的非常纤薄的生物膜。离子通道可以在这种膜上打开一个小的空洞，在膜的两侧施加电压差，这样在膜一侧的带有微量负电荷的分子就可以通过这个小孔到达膜的另一侧。关键的是，在它通过小孔的时候，会对当下的粒子流产生特征性的干扰，利用这一点就可以来判定它是一种什么分子。
[attach]33022[/attach]
“纳米孔测序技术发展势头强劲，几乎每月都有新的进展”

1996年Bayley博士发现一种特定的蛋白α-溶血素（AHL），它不但可以让小的分子通过，而且可以让单条DNA链通过纳米孔。他意识到这可能会是一种新的DNA测序技术。但是让DNA链通过AHL孔道并且同时检测出单个碱基是非常困难的。所以Oxford Nanopore公司也在寻找另外的方法，叫做核酸外切酶测序，并与美国一家快速测序领域的领跑公司——Illumina合作。这种技术也利用了AHL蛋白的纳米孔，但是DNA链不是完整的通过纳米孔，而是另一种情况——将一种叫做核酸外切酶的酶类耦合在AHL的顶端，这种酶可以从DNA链上切下单独的碱基对并让其通过纳米孔，这样就能一次检测一个碱基对了。

Sanghera博士说Oxford Nanopore公司已经基于“芯片实验室”技术，为核酸外切酶测序研发了一种叫做GridION的电子盒系统。每个电子盒包含许多纳米孔（尽管公司并没有说具体数目）和执行准备工作、检测工作及分析工作的所有微流体以及电子器件。它们被安装在一个类似于电脑服务器的一种像基座一样的装置上。并且就像服务器，这些基座可以组合进一个巨大的机箱内来执行大规模的分析工作，给DNA测序或者简单的检测小分子或蛋白。Sanghera博士说这个系统基本上可以投入商用了。

即使如此，最终目的还是要完善单条DNA测序——让序列庞大的DNA链在通过纳米孔的时候得到识读。这会比核酸外切酶测序更快，也会更加精确：因为碱基彼此间仍然相连，不会以错误的顺序通过纳米孔。然而，单条链测序之所以如此之困难，是因为蛋白和双层脂膜两者加起来的厚度意味着一次存在于纳米孔内的碱基数多达15个。另外，DNA链通过纳米孔的速度必须得到控制，以利于有足够的时间来检测每一个碱基。

棘轮效应

2010年末Bayley博士发现了一个方法解决上述第一个问题，而加州大学圣克鲁斯分校的Mark Akeson找到了办法对付第二个问题。Bayley博士对AHL蛋白进行了修饰，在纳米孔中填进了一个阻塞物使孔洞变窄，这样就可能保证通过电流的变化是由单个碱基的通过造成的，这样就可以检测出碱基类型来了。同时Akeson博士将一种聚合酶耦合在了AHL蛋白上，由此构成了一个精巧的棘轮装置。这可以保证DNA链以每个碱基20毫秒的速度通过纳米孔——这个速度足够对每个通过的碱基进行检测了。

然而即使一个纳米孔每秒读取50个碱基，这仍要花费约两年时间来测序整个基因组——大约30亿个碱基。Bayley博士说，所以非常有必要找到方法让许多纳米孔平行工作，每个纳米孔同时对基因组不同的区段进行测序。

另外一种在过去几年取得进展的技术是摒弃蛋白，在固态材料上构造人工纳米孔。IBM和医药界巨擘罗氏公司（Roche）的子部门454生命科学（454 Life Sciences）一直在合作致力于这项研究。他们用电子显微镜在10纳米厚的膜上打出孔径为3纳米的小孔。这些膜结构由3层导电材料氮化钛构成，它们被绝缘的二氧化硅层隔开。当在膜一侧侧施加电压，DNA链就被拉进纳米孔。之后，在膜的金属层一侧施加单独的电场，这样就可以捕捉到第一个碱基对。靠转换电场的极性，DNA链就可以一次一个碱基对地通过纳米孔。



仔细看一下纳米孔测序是如何工作的
1.        DNA分子一串碱基对组成，这些碱基对用遗传密码的化学“字母”——A、T、C、G来表示。人类基因组包含大约30亿个这样的碱基。DNA测序就是将这些碱基的顺序识读出来的过程。
2.        在纳米孔测序技术中，一种特殊的蛋白可以用来在薄膜结构上打出一个洞或孔。在膜的一侧施加电压可以将DNA（带负电）拉进空洞。当DNA的化学碱基通过小孔的时候，它们可以引起细微但是可以识别的电流变化。
3.        仔细测量电流的变化就可以识别出不同的碱基了。DNA的碱基组成顺序这样就可以解读出来了。

这项技术的共同发明者，IBM公司的Stanislav Polonsky说，这个过程会很快。他另外还说，为了得到足够强的信号来识读这些碱基，只需要将每个碱基固定大约1毫秒就可以了。这项工作的大部分是由计算机模拟来完成的，但是棘轮机制是在实验室里证实的。而且，正反两个方向移动DNA都可以，这就有利于进行对测序中出现的错误进行纠正——IBM公司的Stephen Rossnagel说——如果固态纳米孔得到应用的话，现有的芯片制造技术就可以用来制造大量的平行装置，一个芯片不到100美元。

其他人也在关注固态纳米孔——包括哈佛大学的Jene Golovchenko，Oxford Nanopore公司和他也有合作；还有从美国罗得岛州布朗大学分离出来的NabSys公司。这种技术的另一种方式就是利用石墨烯（一种片状碳结构，只有一层原子那么厚）上的纳米孔。因为这种膜结构太纤薄了，一次只能让单个碱基存在于孔内，所以这使得检测容易了很多。

根据伦敦帝国大学的Joshua Edel领导的研究小组的初步试验结果显示，这种技术应该能在数分钟之内测完整个基因组。宾夕法尼亚大学由Marija Drndic领导的另外一个研究小组发现，给石墨烯膜加入几个分子厚的氧化钛层可以让DNA更加容易地通过纳米孔，并且可以减少在测量电流时的噪音水平——这有利于提高精确度。Bayley博士也在关注固态纳米孔，并且在研究一种两全其美的方法：将蛋白通道纳米孔和固态膜结合起来。

毫无疑问纳米孔测序领域发展迅猛，几乎每个月都有新进展。Sanghera博士相信，1000美元测序基因组在3到5年内就会成为可能。他说，受益将是巨大的。比如说，廉价快速的全基因组测序使得对单个病人癌细胞和健康细胞进行全基因组测序成为可能，看看到底哪些基因发生了变化。决定哪种药物会对某个特定病人有作用并且知道为什么起作用会变得更容易。构建一张精细的人类进化以及人类是在什么时候如何扩散到全世界的图谱也成为可能。纳米孔很微小，但是如果能够合理利用，意义将是巨大的。
[attach]33022[/attach]